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细胞凋亡的几种检测方法

一、形态学观察方法
  
  1、HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。
  
  2、丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
  
  3、台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。
  
  4、透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
  
二、DNA凝胶电泳
  
  (一)、检测原理
  
  细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA*断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA*断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180-200bpDNA*断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。
  
  (二)结果判断
  
  正常活细胞DNA电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。
  
三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定
  
  凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA*断组成,可由ELISA法检测。
  

(一)检测步骤
  
  1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;
  
  2、在微定量板上吸附组蛋白体’
  
  3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘
  
  4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’
  
  4、加酶的底物,测光吸收制。
  
(二)用途
  
  该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,适合基层工作,但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。
  
四、流式细胞仪定量分析
  

(一)检测原理
  
  细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。
  
(二)应用价值
  
  流式细胞仪检测具有以下特点:
  
  1)、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确
  
  2)、可以做许多相关性分析
  
  3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期

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